医思倍-《分子生物学实行》之PCR反响与凝胶电泳实行利用树模
实行原理
1.PCR（聚合酶链式反响）
PCR（聚合酶链式反响）是一项体外基因扩增武艺，相似于DNA的天然复制历程，其特异性依托靶序列两头互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸3个基本反响步调构成。
（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃支配一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增构成的双链DNA解离，使之成为单链，以便与引物团结，为下轮反响作准备。
（2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃支配，引物与模板DNA单链的互补序列配对团结。
（3）引物的延伸：DNA模板-引物团结物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响质料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，构成一条新的与模板DNA链互补的半保存复制链。
反复循环变性-退火-延伸历程，就可取得更多的半保存复制链，并且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目标基因扩增几百万倍。抵达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
2.琼脂糖凝胶电泳
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极挪动。由于糖-磷酸骨架在布局上的反复实质，相反数目标双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相反的速率向正极朝向挪动。
核酸染料具有和DNA团结的才能，在紫外灯的照射下，能发射荧光。在DNA marker的标识下，即可推断DNA分子的轻重。
质料、试剂与仪器耗材
1.质料
DNA模板、正向引物、反向引物。
2.试剂
DNA聚合酶（2×Rapid Taq Master Mix）、（灭菌的去离子水）dd、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA 上样缓冲液、DNA Marker、核酸染料等。
3.仪器、耗材
冰盒、医用离心机、涡旋混匀仪、小型离心机、PCR管、移液器、PCR仪、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶成像分析体系。
实行步调
1.PCR反响
（1）取冰盒打好冰，从冰箱中取出DNA模板、正向引物、反向引物、DNA聚合酶：我们用到的诺唯赞2×Rapid Taq Master Mix，试剂全部在冰上天然化冻。
（2）正向引物和反向引物若为干粉，将其放入医用离心机中，12000rpm离心2min。离心后取出，参把守上的含量信息用去离子水将其浓缩。
（3）依据模板和引物数目准备相应数目标PCR管，注意还需一管NTC比力，并做好标签。
（4）依据诺唯赞2×Rapid Taq Master Mix，计划PCR体系：
按上述排序依次向PCR管中到场相应试剂。
注意：除酶外的试剂化冻后都需使用涡旋仪混匀，而酶类的试剂则用手指轻弹混匀。为制止试剂沾染，混匀后用小型离心机暂时离心后方可掀开，还需注意：到场Taq酶PCR管要安排冰上举行，并且到场今后PCR管一直要放在冰上举行利用。
（5）掀开PCR仪，按分析书要求设置反响步骤，具体见下图。
注意：反响步骤最初须加上保存温度16℃。
（6）反响完成，取出PCR管，4℃保存，关闭PCR仪。
2.琼脂糖电泳
（1）称取0.5g琼脂糖倒入100ml锥形瓶中，量取50ml 1×TAE电泳缓冲液倒入锥形瓶中。
（2）微波炉加热至沸腾，拿出摇摆，增速琼脂糖溶解，如此反复3次，每次沸腾5～8秒。
（3）将熔化后的琼脂糖凝胶倒入插好梳子的模具中，缓慢匀速倒下，尽力勿产气愤泡，如有气泡，用枪头剔除。
（4）静置，待琼脂糖凝胶凝结后缓慢垂直拔去梳子。
（5）水平电泳槽中倒入过量1×TAE电泳缓冲液，将琼脂糖凝胶放入电泳槽中。
（6）向整支6×DNA Loading Buffer（1ml）中到场2μl核酸染料，涡旋混匀仪混匀。
（7）取出PCR产物，向此中到场4μl制备好的6×DNA Loading Buffer，混匀，取10μl点入凝胶孔中。并在得当凝胶孔点DNA Marker。
（8）电压150V，电泳30min支配。电泳至蓝色条带至凝胶中部地点支配。
（9）将琼脂糖凝胶取出，放入凝胶成像分析体系中成像。
（10）实行完毕，整理实行台面，关闭实行装备。
注意事项温馨小提示：
（1）试剂使用前都需使用涡旋混匀仪混匀，混匀后不要立刻掀开，需用小型离心机暂时离心后方可掀开，制止沾染。
（2）到场Taq酶PCR管要安排冰上举行，并且到场今后PCR管一直要放在冰上举行利用，以免酶失活。
（3）PCR体系加样时，NCT比力管中模板DNA换为水。
（4）设置PCR仪的步骤时，完毕后温度设为16℃。
（5）微波炉加热时，摇摆锥形瓶时，瓶身很烫，注意警惕烫伤。
（6）倒胶前要测试模具对否水平，若不水平，需调停。
（7）核酸染料剧毒，实行历程中注意使用，一定按要求佩带手套、穿实行服。
